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Nature Communications volume 13, numero articolo: 7962 (2022) Citare questo articolo

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L’attività d,d-transpeptidasi delle proteine leganti la penicillina (PBP) è il noto bersaglio primario degli antibiotici β-lattamici che bloccano la polimerizzazione del peptidoglicano. L’uccisione batterica indotta dai β-lattamici comporta complesse risposte a valle le cui cause e conseguenze sono difficili da risolvere. Qui, utilizziamo la sostituzione funzionale delle PBP con una l, d-transpeptidasi insensibile ai β-lattamici per identificare i geni essenziali per mitigare gli effetti dell'inattivazione delle PBP da parte dei β-lattamici nei batteri che si dividono attivamente. Le funzioni dei 179 geni condizionatamente essenziali identificati da questo approccio si estendono ben oltre i partner della l,d-transpeptidasi per la polimerizzazione del peptidoglicano, includendo proteine coinvolte nella risposta allo stress e nell'assemblaggio dei polimeri della membrana esterna. Gli effetti insospettati dei β-lattamici comprendono la perdita del legame covalente mediato dalle lipoproteine che collega la membrana esterna al peptidoglicano, la destabilizzazione dell'involucro cellulare nonostante l'efficace reticolazione del peptidoglicano e l'aumento della permeabilità della membrana esterna. Quest'ultimo effetto indica che la modalità d'azione dei β-lattamici prevede la penetrazione autopromossa attraverso la membrana esterna.

I batteri Gram-negativi, come l'Escherichia coli, possiedono un involucro multistrato che sostiene la pressione di turgore del citoplasma (peptidoglicano della parete cellulare) e agisce come una barriera chimica selettiva per nutrienti, rifiuti e composti tossici (membrane interne ed esterne) (Fig. 1a)1. Diversi polimeri contenenti porzioni proteiche, peptidiche, glicaniche e lipidiche assicurano le proprietà meccaniche e le funzioni di trasporto dell'involucro. Il peptidoglicano (PG), che è legato covalentemente alla membrana esterna tramite la lipoproteina di Braun, è una macromolecola gigante a forma di rete (circa 109 Da) polimerizzata da un'unità disaccaride-pentapeptide (Fig. 1b). Le glicosiltransferasi catalizzano la formazione di legami glicosidici β −1,4 tra disaccaridi per formare catene di glicani che vengono successivamente reticolate tra loro dalle transpeptidasi (Fig. 1c). Questi ultimi enzimi, le d,d-transpeptidasi, sono chiamati anche proteine leganti la penicillina (PBP) poiché sono i bersagli essenziali degli antibiotici β-lattamici. Per la polimerizzazione del peptidoglicano, le PBP interagiscono con l'estremità d-Ala4-d-Ala5 di uno stelo pentapeptidico (da qui la designazione d,d) e formano un collegamento covalente tra d-Ala4 e il loro residuo Ser nel sito attivo con il concomitante rilascio di d -Ala5. Nella fase successiva, l'enzima acil risultante reagisce con il secondo substrato, molto spesso uno stelo tetrapeptidico, per formare un dimero Tetra-Tetra reticolato 4 → 3 con il concomitante rilascio di PBP (Fig. 1c; Fig. S1a)2. In collaborazione con proteine di impalcatura ed endopeptidasi, le d,d-transpeptidasi mediano l'inserimento dei filamenti di glicani nella macromolecola in espansione a forma di rete PG, determinando così la forma batterica e garantendo una barriera meccanica contro la pressione osmotica del citoplasma durante l'intera cellula ciclo3,4,5,6,7.

a L'involucro è composto da una membrana interna (IM, grigia) ed esterna (OM, nera). Il peptidoglicano (PG, blu) garantisce la protezione osmotica della cellula batterica. L'IM è un doppio strato lipidico composto principalmente da fosfolipidi (PL). L'OM è un doppio strato lipidico asimmetrico: il foglietto interno è composto da PL e quello esterno da lipopolisaccaridi (LPS) e fosfatidilgliceridi sostituiti dall'antigene comune enterobatterico (ECAPGL). b Struttura della subunità PG (GlcNAc, N-acetil-glucosamina; MurNAc, acido N-acetil-muramico). c PG è una macromolecola a forma di rete costituita da catene di glicani (poligoni blu-viola) reticolati insieme da corti steli peptidici (cerchi colorati). Le PBP catalizzano la formazione di 4 → 3 legami incrociati che collegano la quarta posizione di uno stelo donatore di acile alla terza posizione dell'accettore. Due membri della famiglia LDT (YcbB e YnhG) catalizzano la formazione di 3 → 3 legami incrociati. Tre LDT (ErfK, YbiS e YcfS) ancorano la lipoproteina di Braun (Lpp) al PG. Il collegamento di DAP alla terza posizione di uno stelo donatore di PG all'estremità Arg-Lys dell'Lpp fornisce un collegamento covalente tra OM e PG. Il collegamento PG-Lpp viene idrolizzato dallo YafK LDT46,47. d Profilo rpHPLC di muropeptidi dal ceppo BW25113 (ycbB, relA') coltivato senza ceftriaxone. La struttura è dedotta dai frammenti ottenuti dalla digestione della PG con muramidasi che scindono il legame MurNAc-GlcNAc β−1,4. e Struttura dei muropeptidi dedotta da analisi di spettrometria di massa. I dati di origine vengono forniti come file di dati di origine.

90% of the resulting muropeptides recycled by the cell37,38. This involves the retrograde transport of PG fragments into the cytoplasm by specialized permeases, AmpG and the Opp complex, followed by the recycling of the sugar and peptide moieties as glucosamine and tripeptide l-Ala-γ-d-Glu-DAP, respectively (Fig. 4a). Tn-seq analysis showed that genes encoding the AmpG permease and each component of the Opp complex were fully dispensable for growth both in −CRO and +CRO conditions. We further demonstrated that PG recycling was fully dispensable by constructing a ΔampG ΔoppF ΔmppA triple mutant that was found to be viable and resistant to ceftriaxone in spite of the loss of both transporters (Supplementary Fig. S3a). Nevertheless, the cytoplasmic l,d-carboxypeptidase LdcA was essential in the +CRO but not in the −CRO condition (Supplementary Data File 1b; Supplementary Data File 2). This enzyme was previously shown to trim d-Ala4 from recycled tetrapeptide stems to provide the l-Ala-γ-d-Glu-DAP tripeptide that is directly added to UDP-MurNAc by the Mpl ligase39,40. Disruption of the gene encoding LdcA was reported to result in bacteriolysis during stationary growth, attributed to dramatically decreased cross-linking as recycled tetrapeptide stems cannot serve as acyl donors by d,d-transpeptidases (Supplementary Fig. S1)40. The same explanation cannot account for the essential role of LdcA in ceftriaxone resistance since YcbB uses tetrapeptide stems as acyl donors8. Nonetheless, the essential role of LdcA in the +CRO condition stemmed from elimination of imported tetrapeptides since deletion of the mpl gene restored growth of the ΔldcA mutant in the presence of ceftriaxone (Supplementary Fig. S3a). Overexpressing murA, encoding the enzyme catalyzing the first committed step of PG synthesis (Fig. 4a), also restored resistance of the ΔldcA mutant (Supplementary Fig. S3b). Thus, boosting the metabolic flux trough the PG assembly pathway compensates for the toxicity of the imported tetrapeptides. Together, these results indicate that Mpl ligates the tetrapeptide onto UDP-MurNAc and that in the absence of LdcA the resulting tetrapeptide-containing precursors are ineffectively used in subsequent PG synthesis steps and impair the global efficacy of the pathway./p> 40-fold reduction of the MIC of the detergent (Fig. 6b). Growth in the presence of ceftriaxone also increased susceptibility to vancomycin, moenomycin, bacitracin, and erythromycin, which are known to poorly penetrate the outer membrane of Gram-negative bacteria (Fig. 6c). Together, these data indicate that bypass of PBPs by YcbB was associated with the permeabilization of the outer membrane in the presence of ceftriaxone. This implies that the mode of action of β-lactams may involve a positive loop in which binding of the drugs to their targets promotes drug access to the periplasm. Damage to the outer membrane mediated by reactive oxygen species (ROS) may be involved in this process since increased lipid peroxidation was detected by a colorimetric assay (Supplementary Fig. S7h)./p> transposome® (Lucigen). For each electroporation, transformed cells were incubated at 37 °C for 1 h in 2 ml of BHI broth supplemented with 10 µg/ml tetracycline and 20 µg/ml chloramphenicol. Cells were plated on 20 BHI agar plates (100 µl per plate) supplemented with 50 µg/ml kanamycin, 40 µM IPTG, and 1% l-arabinose in the absence (condition −CRO) or presence (condition +CRO) of 8 µg/ml ceftriaxone. Plates were incubated at 37 °C for 16 h (condition −CRO) or 24 h (condition +CRO). Cells were recovered from sets of 20 plates (corresponding to the same electroporation) in two steps by scrapping with 4 ml of BHI broth containing 20% glycerol followed by an additional wash of the plates with 4 ml of the same medium. The bacterial suspensions obtained for each electroporation were kept at −80 °C. For the −CRO condition, a total of 810,000 CFUs was obtained in 7 electroporations. For the +CRO condition, a total of 260,000 CFUs was obtained in 10 electroporations./p> 0.05 or a fold-change < 4 were eliminated. The resulting set of 179 genes is listed in Supplementary Data File 1b. For pathways or gene clusters containing selectively essential genes in the +CRO condition, we also considered non-essential genes displaying a significantly reduced number of insertions in the +CRO condition (p < 0.05). These genes were deemed to incur a fitness cost./p>